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NGS科研用建庫試劑盒
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K02420-S/L   Balancer NGS Library Preparation Kit for small/microRNA – Illumina Compatible

流程介紹
      small/microRNA文庫制備試劑盒能有效去除引物二聚體,并在同樣數據量中獲得更多種類的小RNA。具有單一試管反應、一天工作流程的特點。整個流程從總RNA開始,經過接頭連接、反轉錄、PCR和切膠回收的過程,可構建適合Illumina測序儀的small/microRNA文庫。通過優化實驗流程,有效減少了接頭的二聚體,可以從最少10ng 總RNA中成功完成文庫構建,同時有效降低了連接反應的偏好性(bias),使得客戶能夠在同樣的測序深度來發現更多的小RNA和microRNA,產生更好的科研發現。該產品可被廣泛應用于分析各類臨床樣品(如FFPE樣品和血清/血漿樣本)的總RNA。
 
流程圖
 
 
流程優勢
• 更多地發現——有效去除連接偏好性(bias);
• 更優的數據質量——顯著去除接頭二聚體;
• 優化的實驗流程——單管一天實驗流程。
• 以總RNA作為起始反應物——無須進一步的純化;
• 10ng總RNA便可進行;
• 可應用于血清和FFPE樣品;
• 適合自動化操作。
 
產品信息

貨號

產品名

規格

K02420-S

Balancer NGS Library Preparation Kit for small/microRNA – Illumina Compatible

12 rxn

K02420-L

Balancer NGS Library Preparation Kit for small/microRNA – Illumina Compatible

48 rxn

 
常見問題解答
1. 你們是否處理過血清樣本,對于血清樣本你們是否有什么建議?需要多少血清能夠提取出足夠建庫的total RNA?
      我們處理過大量血清樣本,有優化過的total RNA純化的流程。通常0.5-1ml血清就可以得到建庫足夠的total RNA。當然,這也和血清樣本的保存狀況有關。
 
2. 你們的barcode序列在哪個位置?barcode有多少種?
      我們的barcode序列存在于PCR 引物上,有48種。
 
3. 在實驗過程中比較重要的步驟是哪幾個步驟?
      只要樣本中存在小RNA,按照我們的protocol操作一般是不會出現問題的。需要注意的只有一點:我們建議大家在建庫時做一個不加樣本的負對照,這樣可以清晰的觀察到小RNA的條帶電泳的位置,并和可能產生的引物二聚體區分,這樣不會錯誤回收引物二聚體片段。膠盡量跑遠,割膠前后都要照相。不只一條條帶時分別切膠回收等也都是減少無用數據的方法。
 
4. 你們兩端的接頭加起來長度是多少?所切的片段大小是多少?
      micro RNA試劑盒5’和3’接頭加起來長度是118bp。在切膠回收的時候,會切取140bp-160bp之間的片段。建議做陰性對照,這樣可以清楚的識別出所需要的小RNA。
 
5. 在高通量測序中,小RNA 建庫過程中是通過什么方式來減少引物二聚體的形成的?
      這是我們小RNA文庫制備的試劑盒的另一個主要優勢:在小RNA與3’接頭連接后,加入RT-primer。RT- primer可以與3’接頭互補結合,形成RNA:DNA雙鏈雜合體。這些雙鏈雜合體不能作為RNA連接酶的底物,和后期加入的5’接頭連接,從而減少了引物二聚體的形成。
 
6. 在高通量測序中,小RNA 建庫過程中怎么去除mRNA及rRNA的?在哪步去除?
      小RNA 建庫過程中mRNA和rRNA不需要去除,因為它們不干擾整個反應。在小RNA 接頭連接的時候,所用的RNA連接酶對于長的片段的連接效率低,兩端同時連上接頭的品種大多數是小RNA。少數摻入的mRNA或rRNA會因分子量的不同,在根據片段長度切膠純化的過程中,自然而然地去除了。如果mRNA存在降解,并且降解的mRNA條帶在小RNA條帶附近,在測序結果中會看到這些降解mRNA的存在。
 
7. 在高通量測序中,small RNA文庫構建是怎么解決序列偏好性(bias)的?
      這是我們小RNA文庫制備的試劑盒的主要優勢之一:在5’接頭的連接序列處序列進行了調整,有效去除了序列偏好性。在相同的數據量下,可以找到更多種類的小RNA,去發現別的技術可能丟失的信息。
 
8. 在高通量測序中,small RNA 文庫構建是從total RNA起始的嗎?一般 total RNA 需要的量是多少?最低起始量是多少?
      small RNA 文庫構建是從total RNA起始的。在建庫中,一般total RNA的用量是1ug,最低起始量是10ng。small RNA 建庫的關鍵之處是提取的RNA中是否有small RNA,及含有的small RNA 的多少。不同物種不同樣品提取的small RNA的含量都不同,一般情況下,樣品起始量為1ug total RNA,PCR進行12個循環。
 

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